根据10批便可通片的指纹图谱检测结果,共标出16个共有峰,高效样品峰经与对照品比较分析,液相研究指认出5个共有成分,指纹指标其中2号峰为松果菊苷,及多4号峰为柚皮苷,成分5号峰为新橙皮苷,定量9号峰为芦荟苷,分析15号峰为芦荟大黄素,通片图谱见图2。高效9号峰分离度较好,液相研究峰面积也比较稳定,指纹指标故选择此峰作为参照峰。及多
将10批样品指纹图谱与对照指纹图谱分别导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2004A版)软件进行相似度评价。结果10批便可通片相似度在0.971~0.999之间,定量表明相似度良好,结果见表3。
分别取便可通组方中的各单味药材适量,精密称定,按“2.2.2”项下方法制备药材样品溶液。分别精密吸取供试品溶液和各单味药材样品溶液各10μL进样,注入高效液相色谱仪,记录100min色谱图。对保留时间保持一致的色谱峰进行分析比较,根据紫外光谱信息,对全方与药材指纹图谱的相关峰进行指认,确认共有峰的药材归属,见图3。
确认了便可通片HPLC指纹图谱中16个特征峰的来源,其中2、3号峰来自肉苁蓉,3号峰来自生地黄,3号峰来自玄参,4、5、7号峰来自枳实,1、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16号峰来自芦荟,16号峰来自当归,16号峰来自决明子。火麻仁、桃仁成分多为末端吸收,在该色谱条件下基本无响应,故在样品中未进行共有峰标记。
精密吸取“2.2.1”项下制备的对照品溶液适量,分别加入流动相(或甲醇)稀释成系列质量浓度的对照品溶液进行测定,进样10μL,测定其峰面积,以质量浓度(X)为横坐标,峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线,进行线性回归,得回归方程。结果见表4。
精密称量已知芦荟苷、柚皮苷、新橙皮苷、松果菊苷含量的样品(S1)0.5g,共6份;分别精密加入芦荟苷对照品8.1mg,柚皮苷对照品7.9mg,新橙皮苷对照品8.6mg,松果菊苷对照品溶液(0.5196mg·mL-1)3.5mL,即1.8mg;置50mL棕色量瓶中,按照“2.2.2”项下操作,即得。按“2.1”项下色谱条件进行分析,结果芦荟苷、柚皮苷、新橙皮苷、松果菊苷的平均加样回收率分别为101.62%、99.52%、102.05%和98.35%,RSD分别为2.01%、1.95%、2.21%和2.84%,表明本方法对各成分的加样回收率符合要求。
取10批便可通片样品适量,精密称定,按“2.2.2”项下制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件进行分析。结果见表5。
本研究考察了便可通片不同提取方式(超声提取、加热回流提取),不同提取溶剂(乙醇、水、甲醇、50%甲醇)的提取效果,结果表明以甲醇超声提取效果最佳。
本研究采用DAD检测器全波长扫描的方式,参考处方各单味药材有效成分的检测波长,提取出200、220、235、260、280、300nm等波长下的图谱进行比较,结果发现在300nm下,样品色谱图呈现的色谱峰数目多,且响应值较高。同时考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%冰醋酸水、甲醇-0.2%冰醋酸水4种流动相系统,发现采用甲醇-0.1%冰醋酸水流动相系统,参照峰(芦荟苷)峰型较好,分离度、对称因子和理论塔板数均较好。
本研究对便可通片全方与药材指纹图谱的相关峰进行指认,确认了5个峰的物质成分,主要来自肉苁蓉、枳实、芦荟。肉苁蓉中发挥改善肠胃功能的药效物质基础为苯乙醇苷类化合物,其中松果菊苷能缓解便溏和便血,促进受损肠道肌层表皮细胞的增殖和减少炎性浸润。枳实中柚皮苷、新橙皮苷等黄酮类成分,可改善功能性消化不良大鼠的胃排空和小肠推进;芦荟含有芦荟苷等蒽醌成分,具有泻下通便的功效,故本研究选择松果菊苷、柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷4种成分进行定量测定。含量测定结果表明,便可通片10批样品中松果菊苷、芦荟苷含量变化较大。本研究发现,芦荟苷对照品(甲醇溶解)放置较长时间后会降解成2个峰,分别对应样品中8、9号峰。亦有文献报道芦荟苷大部分是芦荟苷A和芦荟苷B两个光学异构体的混合体,其对照品峰面积的改变直接影响样品中芦荟苷含量的计算。故本实验对芦荟苷对照品的配置进行研究,分别用甲醇、流动相溶解,考察0、2、4、6h芦荟苷降解率。结果表明,芦荟苷在流动相混合溶液中较甲醇溶液中更为稳定。因此,选择芦荟苷作为质控指标尤为重要。
本研究建立了10批便可通片的指纹图谱,采用指纹图谱软件共标定出16个共有峰,相似度均大于0.95,说明所建立的指纹图谱具有较好的可控性,可为便可通片的质量评价提供依据。方法学试验表明该色谱方法可同时定量分析芦荟苷、柚皮苷、新橙皮苷、松果菊苷的含量。采用上述建立的HPLC指纹图谱方法,可同时对便可通片药材、饮片与成品进行指纹图谱检测和有效成分含量测定,实现终端质控向生产过程质量控制过渡,以提升产品质量,稳定产品品质,为便可通片的上市生产奠定了基础。
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